人肺癌组织中单竣酸转运泵基因mRNA表达的变化成党校、钱桂生2，金发光、黄桂君\王建丽1（。第四军医大学唐都医院呼吸科，西安710038；2第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆630037）因RT-PCR产物作为外参照，通过比较同一样本组中及样本组间MCT1MCT2相对于（3-actin的RT-PCR产物的光密度比值，来分析判断MCT1、MCT2 mRNA表达的高低。结果显示，MCT1在人正常肺组织。肺癌组织中的mRNA表达均高于MCT2；MCT1MCT2基因mRNA在人肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常肺组织。推测MCT1可能在肿瘤组织细胞内的由调节方面发挥重要作用。

　　糖酵解是实体肿瘤组织获取能量的一种主要方式，由于糖酵解产生大量的乳酸、丙酮酸等酸性产物，这势必造成细胞内酸化，使细胞生长受到抑制。

　　但实验证明肿瘤组织细胞内pH值反而高于细胞外111；目前研究提示肿瘤细胞膜上除有调节Na+/H+交换的离子泵外，跨膜的单羧酸转运泵（《31-boxylatetranspoter，MCT）可能在细胞内外的乳酸转运及H+调节方面具有重要作用121.MCT的跨膜乳酸转运与H+相偶连，对其研究*初始于缺氧的肌肉组织。1994年，GarciaCK首先克隆出了人的MCT基因，将其命名为MCT1131，以后又有此家族的其他基因先后被克隆出来，分别命名为MCT2、MCT3等14.近年来，MCT在肿瘤方面的研究越来越受到重视。本文通过RT-PCR方法，研究了MCT1、MCT2两个基因亚型在人肺癌、癌旁正常肺组织中mRNA的表达情况。

　　1材料和方法1.1组织标本来源及试剂、仪器人肺癌组织10例（鳞癌3例、小细胞癌3例、腺癌4例）、人癌旁正常肺组织6例均来自我院胸外科的新鲜手术标本，标本均经病理诊断证实为肺癌及癌旁的正常肺组织。收集的标本分装保存于液氮罐中备用。RNA提取试剂Tripue为德国宝灵曼产品；RT及PCR试剂盒分别购自德国宝灵曼及美国Pro-mega公司；琼脂糖由上海生物工程公司提供。LambdaBio20紫外-可见光分管光度仪（美国PE公司产品），PTC-200DNA扩增仪（美国gene公司产品），SX-100凝胶成像分析仪（上海四星生物技术有限公司产品）。

　　1.2肺组织标本总RNA的提取取收集的每例组织标本各1g，用灭RNA酶的无菌剪刀剪碎后，移入灭RNA酶的消毒研磨器内，加入1mLTripue进行研磨，将磨碎的组织液移入灭RNA酶的1.5mLEpendorf管中。RNA提取方法按照Tripue试剂盒说明书中的操作步骤进行。RNA沉淀用30ML灭RNA酶三蒸水稀释，紫外分光光度仪下测定OD260nm/D280nm值并进行RNA纯度及含量计算，根据所测的总RNA含量将RNA进一步用灭RNA酶三蒸水稀释至2Mg/L.逆转录步骤参照宝灵曼试剂盒说明书进行。取（0.5凡）、加灭RNA酶三蒸水至10UL于250ML的PCR管内。PCR仪内65°C、10min后，冰上冷却至0°c，分别加入5X缓冲液4UL、100mmol基金项目：国家自然科学基金（39900067）基础医学与临床用灭RNA酶三蒸水补足体积至20ML.PCR仪中42°C1h、65K10min1%琼脂糖凝胶电泳证明逆转录产物。MCT1、MCT2及人屮actin的PCR引物分别根据Genbank中人心肌细胞MCT1 cDNA序列、人肝细胞MCT2cDNA序列及人细胞浆中的P-actincD-NA序列进行设计，应用引物设计软件设计的MCT1、MCT2及P-actin上下游引物分别如下：（1）MCT1：上3'，下游引物（1448件均为：95°C预变性°C预变性30个循环；72 1%琼脂糖凝胶上电泳并与Maker（DNA/EcoRI+Hindl-）比较判断PCR产物片段大小。

　　1.4MCHMCT2基因mRNA表达的半定量分析MCT1、MCT2基因mRNA表达丰度的半定量是根据通过不同组织样本中的MCT1、MCT2基因与P- actin基因的RT-PCR产物进行比较，从而判断MCT1、MCT2基因mRNA在不同组织、细胞中表达丰度的高低。为了建立可比性，在RT-PCR步骤及其产物琼脂糖凝胶电泳过程中采取了以下措施：（1）正常肺组织及肺癌组织提取的总RNA均经紫外分光光度仪测定其纯度及含量。用于逆转录（RT）步骤中的标本总RNA，其A260nm 280nm比值均大于1.90，各样本在做RT时均取2ML总RNA进行逆转录。（2）PCR扩增步骤中各样本cDNA加入体积（取5凡）完全相同。MCT1、MCT2的PCR反应选用一管反应法。P-actin基因mRNA由于表达丰度高，且PCR反应条件与MCT1、MCT2不同，无法作为内参照，故采取异管扩增，其PCR产物与MCT1、MCT2加于同一泳道作为外参照。（3）1%琼脂糖凝胶电泳时每一泳道加入不同样本的MCT1、MCT2及P-actin的PCR产物的体积（取10ML）均相同。应用凝胶成像系统摄取各样本在同一凝胶上的电泳图，通过成像tinPCR产物条带的光密度值，计算MCT1及MCT2与P-actin条带的光密度的相对比值，通过比较不同样本的MCT1、MCT2相对值，从而比较不同组织、细胞中mENA表达的高低。

　　2结果应用引物设计软件设计的MCT1、MCT2及P-ac-tin基因PCR引物，在人肺癌、癌旁正常肺组织中均成功的扩增出相应基因的PCR产物，且PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳与marker（XDNA+EcoRl+HindD比较证实扩增的目的基因片段与引物设计时推测扩增的目的片段大小完全吻合。、分别为人正常肺组织及人肺癌组织的MCT1、MCT2及P-actinPCR产物电泳结果。

　　人癌旁正常肺组织（6例）的RT-PCR产物电泳结果22mRNA表达的半定量分析结果表达半定量分析结果：将中的每一泳道中的P-actin条带的光密度值设定为1，应用四星凝胶成像系统分析软件中的PCR定量一项分别求出每一泳道中MCT1、MCT2条带光密度值与P-actin光密度值的比值，即为每一基因mRNA表达的相对量。6例癌旁正常肺组织的MCT1 t检验，0.01.说明正常肺组织中MCT1的mRNA分析软件计算比较每！泳道中MCT1-MCT2及P-ac-表达显著高于2.2210例人肺癌组织的MCT1、MCT2 mRNA表达半定量分析结果；中每条泳道中的MCT1、MCT2的mRNA表达相对量分析方法同前。其值1~10泳（）！=0.207±0.004）mRNA表达相对值均数比较，经团体t检验其P值均小于0.01.说明MCT1、MCT2基因mRNA在人肺癌组织