近几年来，抗体已较多地应用于基础研究与临床，但由于mAb的鼠源性而大大限制了其在临床上应用，由此相继出现了基因工程抗体和噬菌体抗体库技术。我们通过噬菌体展示技术制备钠泵抑制物（又称内源性卩圭巴因，endogenousouabain，EO）单链抗体库，以期从中筛选到钠泵抑制物单链抗体。
基金项目：国家医药技术创新博士项目（98-B-07）及西省科技研究发展计划项目（96K12~G8）学**医院心脏内科，主治医师，博士（导师吕卓人）。Tel.（029）1材料和方法1.1材料RNA及mRNA提取试剂盒分别为美国Gbco公司及美国Bio101公司产品。逆转录酶为Pharmacia公司产品。TaqDNA聚合酶为美国公司产品；。为Clontech公司产品1和2分别为Vh基因5端和3端引物，用来扩增鼠IgVh基因；②Light-chainprimer-mix为10种Vl基因引物的混合物，用来扩增鼠Ig该引物两端的各24个碱基分别与Vh和Vl基因的3端和5端相互补，从而可将Vh和Vl基因片段拼接成ScFv基因；④RSprimermix为带有Sf位点的重链基因5端引物和带有NotI位点的轻链基因3端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段同时引入克隆位点。噬菌粒载体pCANTAB 5E为Pharmacia公司产品。其中含有氨苄抗性基因青霉素至终浓度为100mg°L-1和葡萄糖至终浓度1）1h.至对数生长期后，加入M13KO7辅助噬菌体，37C振荡培养1h.离心，弃上清后将沉淀细胞再悬浮于2XYTAK（含有100mg.L-1氨苄青霉素和50mg.L-1卡那霉素的2 1.2方法6wk龄雌性BALB/c小鼠（本校实验动物中心提供）体质量17~（ovalbumin）免疫小鼠，每隔4wk免疫1次，共免疫3次，末次免疫后3d，取免疫效果较好的小鼠立即处死，迅速取出脾脏，分离淋巴细胞，按TRIzol试剂说明书要求提取细胞总RNA，用Bio101试剂盒提取mRNA参照Pharmacia公司的逆转录系统产品说明书，以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下37C 1h合成cDNA第1条链。以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，用通用引物进行全套Vh和Vl基因的扩增。纯化回收的Vh，Vl基因片段与Linkerprimermix以相同或接近等摩尔浓度混合进行重叠延伸PCR反应，从2结果2.1OUA~OVA的免疫效果以50Mg次的OUA-OVA免疫BALB/c小鼠，ELISA法测血清中抗体的效价*高可达1：2.2全套Vh，Vl基因片段的扩增和鉴定以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，加入针对鼠％V区基因不同家族的重链和k轻链可变区引物进行PCR，即得到了全套抗体Vh和Vl基因。电泳结果显示，扩增出的Vh基因片段约为350bp，VL约为325bp，Vh略大于Vl（Fig1），与预期的片段大小相符。 Vh，Vl基因库的PCR扩增结果而将全套Vh，Vl基因随机拼接成ScFv基因库。以RSprimer为引物将拼接的ScFv扩增，同时在5及3端分别加上S/il，Notl酶切位点。用S/il和NotI消化ScFv，将全套ScFv基因片段与pCANTAB5E载体在T4DNA连接酶（5~7）U作用下进行连接。同时作载体自连和阳性插入（controlinsert）对照。 用HoRad电转化仪将连接产物转化入TG1感受态细胞，37°C摇床1h后，取100ML涂于SOBAG（含有100mg.L-1氨苄青霉素和20g.L-1葡萄糖的SOB培养基琼脂板上，30°C培养24h.从生长良好的SOBAG平皿上挑取12个单菌落提取质粒用EcoS和Hi.ndll进行酶切鉴定。取部分菌液加氨苄2.3全套ScFv基因的拼接和PCR扩增将纯化回收后的Vh和Vl基因片段，经过定量，各取Vh和Vl50ng与Linker-Primer混合。经7次重叠延伸反应，可将Vh，Vl基因片段随机连接成VH-Linker-VL（ScFv）。以此为模板，再以RSprime进行第2次扩增，在Vh基因5端加上S/位点，Jk基因3端加上NotI位点。电泳结果表明，扩增产物约为720bp（Fig和Notl消化后，将纯化的ScFv基因克隆入pCANTAB5E载体中，以全部连接产物电转化TGi细胞，转化效率*高可达8< 1011.Mg-1，然后在SOBAG选择性固相培养基上筛选转化的菌落。在载体自连对照和无连接产物转化菌的平皿上，均无单菌落生成；而在阳性插入对照和连接产物转化菌平皿上，均见大量单个菌落形成。随机挑选12个单菌落制备噬菌粒DNA，以EoRl和Hindlll双酶切鉴定，10个单菌落所提噬菌粒DNA切出了约为2条带（含有外源插段），与预测结果一致（Fig3），表明克隆较成功，所构建的噬菌体抗体库库容量约为1.2X 108，由于经过2次PCR有重复克隆的存在，实际的库容量可能没有这么大。噬菌粒文库经过M13K07超感染后，产生的重组噬菌粒可释放于细菌培养上清中，经噬斑计数，滴度为9<1tfpfu. ScFv重组噬菌粒克隆的酶切鉴定一种类固醇激素，可能通过抑制钠泵活性，影响N‘ca+交换而致血压升高。多种高血压动物模型及高血压病人体内钠泵抑制物含量均明显增加，为高血压发生的重要原因之一，成为高血压研究的又一热点。E0升高血压的机制目前尚不完全清楚，EO与高血压间的联系可能是通过改变钠泵构型以及改变钠泵各亚单位在组织中的重分布，从而抑制Na+，IK-ATP酶，增加细胞内Na+，刺激Ca+摄取和平滑肌反应性，继发性地引起一系列细胞生物学的改变。①抑制Na+，1C -ca+交换，细胞内ca+增多直接引起血压收缩；②钠泵受抑制后中枢交感神经活性增加；③通过抑制钠泵活性而迅速增加神经突触释放神经递质，增加外周交感神经系统活性；④增加阻力血管对内源性血管加压物质敏感性，降低驰张因子作用；⑤通过增加醛固酮水平，进一步促进钠水潴留，提高血管张力；⑥刺激血管平滑肌增生，使周围小血管阻力增加；⑦促进内皮细胞分泌内皮素；⑧使压力反射系统敏感性降低。 我们的研究表明“一肾一夹”高血压大鼠体内钠泵抑制物含量增加，钠泵抑制物多克隆抗体通过特异性地与钠泵抑制物结合而降低其血压，但同时也发现钠泵抑制物多克隆抗体存在轻度过敏反应，而噬菌体抗体库技术制备的钠泵抑制物单链抗体由于不含有Ig的Fc段而大大降低抗体的鼠源性，同时又保留了抗体的特异亲和活性。 利用噬菌体抗体库技术制备抗体是继基因工程抗体后分子生物学领域的又一场革命，外源基因产物通过与噬菌体外壳蛋白融合呈现在噬菌体表面，将抗原固定在包被板上，经过几轮“吸附-先脱扩增”，便可得到目的抗体。它的*大优势是不经免疫可以直接从正常人外周血、淋巴结、骨髓构建的噬菌体抗体库中筛选得到人源性抗体。在构建噬菌体抗体库方面有诸多技术尚需要探讨：①得到纯度、完整性好的mRNA是整个实验成功与否的关键，它决定了构建库的质量和效率及下面操作的难易程度；②由重叠延伸PCR将全套Vh，Vl随机拼接成全套ScFv是整个实验中较难的一步。这要求Vh，Vl和linker三者等摩尔混合，Vh，Vl各50ng拼接成功的概率*大；③电转化效率是决定库容量的关键因素。 噬菌体抗体库技术成为制备单克隆抗体的有效手段，已取得了令人鼓舞的成就，预示着其良好的发展前景。 3讨论